Resumo

Enterococcus faecalis é uma bactéria gram positiva encontrada naturalmente no intestino humano e de outros animais e resiste a extremos de temperatura e pH, estresse oxidativo, altas concentrações de sais, ácidos biliares, detergentes e antimicrobianos. Devido ao aumento de infecções hospitalares causadas por esta espécie nas últimas décadas, procura-se explorar os genes de regulação de E. faecalis envolvidos com resistência e virulência. Para tanto, foi estudada a proteína PerR (Peroxide Regulator), um fator de transcrição relacionado com o controle da virulência e possivelmente com o estresse oxidativo na bactéria. Este trabalho visa buscar futuramente inibidores baseados na estrutura da PerR que possam atenuar os danos causados pela infecção por E. faecalis. A linhagem de expressão E. coli M15 (pREP4) contendo o gene perR clonado no vetor de expressão pQE30(QIAGEN) foi submetida à  padronização da expressão da proteína PerR. Realizou-se ainda padronização da purificação da mesma e estudos preliminares sobre a sua estrutura secundária e seu estado de agregação. A melhor condição produzindo 1,75 mg/L foi possível realizando expressão por 3 horas em 1 litro de meio 2XYT, a 37C após indução (DO600= 0,5) com 1 mM de IPTG. A suspensão das células centrifugadas foi feita em tampão Tris-HCl 50 mM, NaCl 200 mM, 10 mM de imidazol, 10% glicerol em pH = 7,5. Posteriormente, realizou-se lise por sonicação (7' com ciclos de 30´´ de sonicação e 30´´ de descanso), cromatografia de afinidade em coluna de níquel Ni-NTA Superflow(QIAGEN) com eluição da proteí­na em 20 mL de tampão Tris-HCl 50 mM, NaCl 200mM, 300 mM de imidazol, pH = 7,5 seguida de cromatografia por exclusão molecular em equipamento de FPLC AKTApurifier(GE Healthcare) com coluna cromatográfica Hiload 16/60 Superdex 75 (GE Healthcare) em tampão Tris-HCl 20 mM, NaCl 200mM. Análises feitas utilizando-se a curva de calibração da coluna de gel-filtração indicam a formação de um possível trímero. Observações feitas realizando-se Dicroísmo Circular apresentam informações acerca da temperatura de desnaturação protéica próximo aos 40C. Dynamic Light Scattering (DLS) indicou aumento no estado de agregação a partir de 50C. Os ensaios realizados para o estudo da proteína permitem um avanço na obtenção das características estruturais para que em passos futuros, possam-se realizar testes de inibição protéica.